Диагностика вируса мешотчатого расплода методом ПЦР в полевых условиях

Середина Т.А.1, Келин Л.В.2, Рябова А.А.2

1 ООО «МБС-Технология», г. Новосибирск

 2 ООО «Северный стиль», Москва

Вирус мешотчатого расплода (SBV) является одним из самых распространенных в мире и вызывает гибель личинок. Часто возбудитель SBV на пасеку заносится с плодной маткой с пчелоразведенческих хозяйств. Своевременная диагностика наличия вируса мешотчатого расплода представляет собой острую проблему для пчеловодов. В связи с этим нами разработан тест на основе изотермального ПЦР для определения вируса мешотчатого расплода.

 Ключевые слова: вирус мешотчатого расплода, вирусоносительство, полевой изотермальный ПЦР.

Вирус мешотчатого расплода (sacbrood virus, SBV) является одним из самых распространенных в мире, он зарегистрирован в США, Англии, Австрии, Швейцарии, России и других странах мира.

В настоящее время мешотчатый расплод пчел широко распространен в России и приносит значительный экономический ущерб, вызывая гибель семей пчел.

Мешотчатый расплод представляет собой вирусное заболевание медоносных пчел. Вирус мешотчатого расплода относится к семейству пикорнавирусов. Вирусные частицы составляют 28 нм в диаметре, безоболочечные, округлой формы. SBV – первый вирус пчел, который полностью секвенирован; геномная РНК длиннее на 8 832 нуклеотида [nt] гена типичных пикорнавирусов млекопитающих (приблизительно 7500 нт), и содержит одну большую открытую рамку считывания (nt 179-8752), кодирующую полипротеин из 2885 аминокислот. Геномная организация SBV явно напоминает характер типичных членов Picornaviridae, со структурными генами на 5'-конце и неструктурными генами на 3'-конце, расположенных в аналогичном порядке. Последовательное сравнение показало, что SBV отдаленно связан с вирусом инфекционной фляшерии тутового шелкопряда (IFV), вирусом, который обладает геномом подобного размера и порядком генов [1].

Наиболее восприимчивыми к SBV являются личинки 2–3-дневного возраста. Продолжительность скрытого (инкубационного) периода 5–6 дней. Клинические признаки SBV характерно выглядят на расплоде пчел. Пораженный расплод на соте имеет пестрый вид, печатный расплод беспорядочно чередуется с открытым, крышечки на многих ячейках с печатным расплодом продырявлены или удалены полностью, видны вытянувшиеся погибшие личинки с приподнятыми головными концами, кольца на их теле сохраняются, запах отсутствует. 

В сильно ослабевших семьях отмечается гибель личинок в более молодом возрасте, до запечатывания. Взрослые пчелы, зараженные вирусом мешотчатого расплода, не проявляют признаков заболевания, хотя вирус размножается в значительных количествах в их глоточных железах. Молодые пчелы после заражения довольно быстро перестают кормить личинок и раньше времени становятся фуражирами, т.е. стареют [2].

Вирус сохраняется в организме маток и рабочих пчел от одного до другого сезона. Вирус устойчив к воздействию физико-химических факторов. При комнатной температуре он сохраняется в течение трех недель, в меде – до 30 дней, на сотах – 80–90 суток, в перге – 100–105 дней, в гнилостной массе – 7–10 суток. В воде при температуре 59 ?С в течение 10 минут инактивируется, а при 80 ?С - моментально, при воздействии прямых солнечных лучей – через 4–7 часов, в высушенном состоянии – через 21 сутки. Источником инфекции при мешотчатом расплоде являются больные пчелиные семьи. Одна больная предкуколка способна заразить до 3000 здоровых личинок. Заражение личинок взрослыми пчелами происходит при кормлении инфицированным медом и пергой. Взрослые внутриульевые рабочие пчелы при чистке ячеек сотов и удалении из гнезда трупов предкуколок загрязняют свой ротовой аппарат и становятся при этом вирусоносителями. От больной пчелиной семьи к здоровым вирусам попадают с блуждающими пчелами и трутнями, пчелами-воровками, другими видами насекомых и вредителей медоносных пчел, во время перестановки зараженных сотов из больных семей в здоровые, через инфицированный пчеловодческий инвентарь и поилки, где воду пьют инфицированные пчелы. Болезнь протекает сезонно: в северных областях и в средней полосе России заболевание регистрируется весной и в первой половине лета (июнь), в южных регионах — в мае. Максимального развития болезнь достигает после холодной, дождливой погоды при недостатке перги и меда в семьях [3].

Сотрудники лаборатории болезни пчел ФГБНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко проводили наблюдения за возникновением и течением мешотчатого расплода на ранее благополучных пасеках, что позволило им понять эпизоотический процесс. Возбудитель на пасеку заносится с плодной маткой с пчелоразведенческих хозяйств. На вирусы этот материал не исследуется до сих пор [2].

Чаще всего происходит это так. На пасеке формируют новую семью на полученную матку. Матка откладывает яйца, пораженные вирусом мешотчатого расплода. Болезнь развивается медленно, пчелы быстро убирают погибших личинок из ячеек и клинических признаков не выявляют. В связи с тем, что вирус мешотчатого расплода размножается в клетках гипофарингиальных желез и жирового тела пчел, продолжительность жизни таких пчел сокращается в два и более раза. С момента формирования клуба пчеловод прекращает осмотр семей и не видит, что происходит с пчелами. К моменту выставки и первому осмотру после зимовки устанавливает ослабление силы семей, опоношенность гнезд, гибель части семей. Все это объясняют плохой акклиматизацией южных пород пчел. Но не придают значения, что пчелы поражены вирусом мешотчатого расплода. 

Диагноз на мешотчатый расплод ставят на основании характерных клинических признаков болезни, результатов серологического исследования патологического материала (кусочек сота 10?15 см с пораженными предкуколками) в ветеринарной лаборатории и учетом эпизоотической ситуации по данной болезни в районе. При выявлении положительных образцов на присутствие вируса мешотчатого расплода проводят комплекс мероприятий по устранению заболевания и профилактике распространения инфекции.

Своевременная диагностика наличия вируса мешотчатого расплода представляет собой острую проблему для пчеловодов. Наиболее подходящим по чувствительности и специфичности методом диагностики является полимеразная цепная реакция (ПЦР), однако в классическом варианте для ее проведения требуется специализированное лабораторное оборудование. Недавно предложенная разновидность ПЦР-изотермальный ПЦР (LAMP-Loopmediatedisothermalamplification, петлевая изотермическая амплификация) не имеет ограничений по оборудованию и позволяет проводить анализ в полевых условиях [4]. Ранее было показано, что  изотермальная ПЦР успешно используется для определения различных инфекций [5, 6, 7].

В случае разработанного теста для определения вируса мешотчатого расплода процедура анализа очень проста: личинку медоносной пчелы, которую нужно проанализировать, помещают в пробирку, которая содержит все необходимое для экспресс-экстракции РНК вируса. После интенсивного встряхивания и 15-минутной инкубации в растворе для экспресс-экстракции, полученный образец РНК вносят в пробирку с готовой реакционной смесью и в портативном приборе (портативный нагреватель, работающий от 5 В и 2 А, позволяющий нагревать содержимое пробирки до 60 ?С и поддерживающий данную температуру в течение 30 минут) проводят изотермальный ПЦР анализ. Весь анализ занимает 45 минут (15 минут выделение, 30 минут постановка реакции изотермального ПЦР). Детекция результатов осуществляется визуально - путем прямого сравнения результата с положительным контрольным образцом (ПКО) и отрицательным контрольным образцом (ОКО) (рисунок 1).

Чувствительность теста составляет до 104 копий вирусной РНК на 1 мл (в фазе стремительного размножения вируса вирусная нагрузка может достигать 1012 вирусных частиц на мл).  Специфичность набора реагентов составляет 100%.

В состав набора реагентов входит: отрицательный контрольный образец (ОКО), положительный контрольный образец (ПКО), пробирки с готовой смесью для проведения изотермального ПЦР. Дополнительно к набору поставляется портативный прибор-нагреватель с датчиками температуры, работающий от сети 5 В.

Рисунок 1. Результат изотермального ПЦР анализа образца личинки на присутствие вируса мешотчатого расплода.

Разработанный тест для определения вируса мешотчатого расплода призван контролировать наличие и распространение инфекции. В дальнейшем авторы разработки планируют сделать полевой изотермальный ПЦР для АBV (вирус острого и хронического паралича пчел). А также разработать технологию взятия гемолимфы у маток пчел без нанесения ущерба ее функциям. Это необходимо для контроля маток на вирусоносительство. На сегодняшний день пчеловод не имеет возможности проверить наличие вируса при приобретении маток и пчелопакетов. В продажу полевые изотермальные ПЦР поступят к концу 2018 года. Информация будет размещена на сайте www.Endoviraza.com.

Литература:

  1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC96016/
  2. http://www.apiworld.ru/1510817121.html
  3. https://vetvo.ru/meshotchatyj-rasplod.html
  4. Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA / Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., Hase T. // Nucleic acids research, 2000. – N. 28, S. 63. 
  5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4782670/
  6. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC540134/
  7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21640758

 

 

Diagnosis of sacbrood virus by PCR in field conditions

Seredina T. A. 1, Kelin L. V. 2, Ryabova A. A. 2

1 LTD "MBS-Technology", Novosibirsk

2 LTD "Northern style", Moscow

The sacbrood virus (SBV) is one of the most common in the world and causes the death of larvae.  Often, the causative agent of SBV is brought to the apiary with the fruit uterus from bee farms. Timely diagnosis of the presence of the sacbrood virus is an issue for beekeepers. In this regard, we have developed a test based on isothermal PCR to determine sacbrood virus.

Key words: sacbrood virus, viral carrier, field isothermal PCR.

 

© www.rnsp.su 2018